DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要組成之一、在動物、植物和微生物的生長發(fā)育、基因表達調(diào)控以及抗逆脅迫中起著至關(guān)重要作用。植物中約有20-30%的基因組胞嘧啶處于甲基化狀態(tài),并分布于CG,CHG和CHH位點(H= A、G或T)。隨著功能基因組學研究的深入,植物基因組DNA甲基化研究已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點之一,而且開發(fā)出了一系列的DNA甲基化檢測方法。根據(jù)研究內(nèi)容和目的的不同,可分為檢測全基因組甲基化和特異性位點甲基化兩類方法,其中后者研究方法主要使用重亞硫酸鹽限制酶組合分析(COBRA)、甲基化特異性PCR(MSP)和重亞硫酸鹽測序法(Bisulfite Sequencing)為主。然而,隨著上述方法在植物上的不斷應用,發(fā)現(xiàn)其中仍然存在一些較棘手的技術(shù)性問題,如:植物基因組CG含量高;基因組DNA修飾后,未甲基化的C變成T,再配合原序列中的T,致使T堿基的豐度極高,從而導致植物特異性位點引物極難設(shè)計/無法設(shè)計引物;DNA目的片段重亞硫酸鹽修飾后擴增結(jié)果不理想和測序后甲基化率不穩(wěn)定。目前,幾乎suo的生物技術(shù)公司均不提供植物甲基化引物方面的設(shè)計服務(wù),動物甲基化研究中的焦磷酸測序和飛行質(zhì)譜測序均無法在植物中應用,也間接說明甲基化引物設(shè)計的難度很高。
土壤污染生態(tài)組博士后王鶴潼等在劉宛研究員的指導下,通過設(shè)計大量引物,發(fā)現(xiàn)17 ~ 30 bp短引物較宜使用Touch-down程序PCR,但特異性差、成功率低;31 ~ 50 bp長引物使用55℃退火60℃延伸的PCR條件其成功率最高,其中反向引物的長度及Tm小于正向引物較佳;高保真酶因其3’→5’外切酶活性不宜用于甲基化研究,而EpiTaq? HS在PCR結(jié)果中表現(xiàn)最佳。本研究首次對植物特異性位點甲基化研究中的難點引物設(shè)計問題進行了方法性探討,總結(jié)了2類引物的設(shè)計方法及原則,為植物特異性位點甲基化研究提供了方法性依據(jù)和指導。該改良方法的文章《植物位點特異性甲基化研究的引物設(shè)計及PCR體系優(yōu)化》已發(fā)表于《農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報》(已接受)。
目前,植物全基因組甲基化研究方法主要以芯片技術(shù)、高效液相色譜法、基于甲基化敏感內(nèi)切酶(如:Methylation Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP和Methylation-sensitive Arbitrarily Primed PCR, MSAP-PCR等)和基于Southern探針雜交(如:CGI array和cDNA microarray等)的方法為主。由于芯片技術(shù)需要開發(fā)大量探針且成本較高,而高效液相色譜法條件優(yōu)化較復雜。土壤污染生態(tài)組還研究出了植物全基因組甲基化研究新的測定方法-改進MSAP-PCR技術(shù)(改進MSAP-PCR技術(shù)應用于Cd脅迫下擬南芥DNA 甲基化分析,農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2015,34:1618-1624)。
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王鶴潼博士等應用改進的MSAP-PCR、簡單序列重復(SSR)和隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)技術(shù),研究了Cd脅迫下擬南芥幼苗基因組DNA損傷的變化趨勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn): (1) 0.25、1.0、4.0和5.0 ppm Cd脅迫15天后,擬南芥幼苗全基因組的甲基化多態(tài)性、CpG位點和CHG位點甲基化位點數(shù)均明顯增加,表現(xiàn)為倒U字型變化趨勢。(2) 4.0 ppm Cd脅迫15天后,幼苗表現(xiàn)為微弱的RAPD多態(tài)性; 5.0 ppm Cd脅迫15天后,0.25和1.0ppm處理21天幼苗均表現(xiàn)為較高的RAPD多態(tài)性。(3) 0.25-5.0 ppm Cd脅迫15天后,使用46對SSR引物沒有檢測出SSR變異;8.0ppm Cd脅迫15天后產(chǎn)生一個重復序列的SSR變異。上述結(jié)果表明,對Cd脅迫最敏感性的生物標記物是甲基化化多態(tài)性MSAP-PCR,RAPD多態(tài)性次之,SSR多態(tài)性最差。該研究對Cd污染土壤/水體的早期預警和早期診斷提供了重要的參考價值。研究結(jié)果Cadmium-induced genomic instability in Arabidopsis: molecular toxicological biomarkers for early diagnosis of cadmium stress在線發(fā)表于環(huán)境類雜志Chemsphere ( 2016, 150: 258-265)。 |




